1. 技术简介

实时荧光定量PCR(real-time quantitativePCR),是指在PCR反应体系中加入荧光染料SYBR或荧光标记的特异性探针，利用荧光信号的积累实时在线监控PCR反应过程，由于在PCR扩增基因的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，可以实现对目的基因在样本中的相对定量或绝对定量。

荧光定量PCR不仅实现真正实现了绝对定量，而且具有灵敏度和特异性、高能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，实时荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景十分广阔。

2. 方法介绍

根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质有荧光染料和荧光探针两类，根据使用荧光物质不同，该技术常用的方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。

2.1 SYBR Green染料法

目前主要使用的荧光染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I是一种能与DNA双链小沟的特异性结合染料。游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，而结合双链DNA后，则会发射荧光信号。在荧光定量PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产 物不断积累，荧光信号也会相应的增加，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。

荧光染料的优点：使用简便；可以与任何PCR产物结合；价格便宜

2.2 TaqMan探针法

Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，根据目的基因设计合成特异性的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。

正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

TaqMan探针技术的优点：

荧光背景低；

敏感性高；

稳定性高；

特异性高。

  3.  实验方法

（1）根据目的基因序列分别设计特异性的引物或者荧光探针；

（2）提取各样本DNA/RNA、RNA反转录、跑电泳、测浓度；

（3）去基因组DNA，RNA反转录；

（4）配置PCR反应体系，加入模板、引物、染料和dNTP等体系所需的溶液；

（5） RealTime PCR(荧光定量PC  R)扩增，

（6）拿到下机数据，进行扩增曲线、溶解曲线、表达量差异等分析。

4. 案例分析

4.1 RNA提取

华丘生物根据客户的样本类型采用对应的提取试剂盒提取.RNA的质量在定量中非常作用，除了在RNA抽提过程中需要严格按照要求操作外，我们希望客户提供新鲜的材料，在严谨的RNA抽提操作中获得更高品质的RNA。

图1 RNA凝胶电泳图

4.2 荧光定量PCR反应

反应过程中，通过扩增曲线图形即可初步判断扩增效率，通过溶解曲线可评估扩增产物的特异性。下图为使用仪器自带软件导出的扩增曲线和溶解曲线图，我们会对每一个样品进行3复孔平行扩增，并拟合扩增曲线及溶解曲线。

4.3 荧光定量PCR实验数据分析

每样品分三复孔平行检测，根据PCR扩增的CT值，计算样本中目的基因的相对/绝对表达量。

图2 基因相对表达量柱状图