TMT技术

1. TMT技术简介

TMT(Tandem Mass Tags)技术是由Thermo公司开发的体外标记蛋白质的技术，主要用于蛋白质的定性和定量研究，是目前运用最广泛的标记定量蛋白质组技术之一。TMT技术最多可采用11种稳定同位素标签，可同时比较多达16种不同样本中蛋白质的相对含量，可标记几乎所有的肽或蛋白质样品。在体外通过与氨基酸N端及侧链的伯胺基团发生反应，多肽的氨基基团，再通过质谱高分辨率质谱仪串联分析方法，高通量的筛选不同样本间总蛋白质组的表达差异，可同时比较16种不同样品中蛋白质的相对含量。

2. TMT标记原理

TMT标记试剂由三部分组成：同位素报告基团（Report Group），平衡基团（Balance Group），胺基反应基团（amine Reactive Group）。

氨基反应基团，可以和肽段 N 端氨基和赖氨酸侧链的伯胺基团发生反应，该基团可以和任意肽段反应，从而使全部肽段标记上TMT标签。

报告基团，作为定量组分或报告离子，不同TMT标签的报告基团有不同的质量，总共有16种，因此TMT最多可以标记16个样本；

平衡基团，与报告基团相互配合，使得不同的TMT标签试剂分子量相同，保证TMT试剂标记的不同样本同一肽段具有相同的质量；

3. TMT实验原理

TMT定量方法可以在一次串联质谱实验中同时比较16个样品中的蛋白的相对含量。一组TMT标签试剂里的所有标签，均带有相同的质量数量。TMT试剂通过肽反应基团与多肽的N末端或侧链的伯胺基团共价结合，从而使全部肽段标记上TMT标签，根据具有不同质量数的报告基团来区分样本。在一级质谱时，平衡基团可以使其与报告基团的总和具有相同的质荷比值，报告基团则给出不同样品中标记肽段的相对强度；肽段在进入二级质谱时，质量报告基团因碎裂而被释放，在质谱低质量区产生报告离子峰，该质谱信号强度值反应了某一种肽段在不同样本中的相对丰度值。

这种技术方法的优势是：定量准确，数据重现性好，灵敏度高对样品要求量低，检测蛋白数量多，另外可同时实现多组样本比较，当样品数量大于16种时，可在每次上机时增加内参样品，实现多次上机数据之间的比较。

4. TMT实验流程

（1）收集样本并分别对样本进行蛋白质提取定和定量；

（2）对蛋白质进行进行还原、烷基化后酶解，得到多肽混合物；

（3） 用TMT试剂对各组样本的肽段混合物进行标记，使不同TMT试剂标记样品中的所有肽，并等量混合各组标记后的多肽样本；

（4）对混合后的多肽样品进行Orbitrap LC-MS/MS质谱检测及分析；

（5）收集一级质谱图中同一个峰的样品，得到不同样品的相同肽段混合物，进行二级质谱，得到二级质谱图；

（6）将离子丰度等相关数据经过软件处理，结合数据库对比分析，可获得不同样品间相同肽段的定量信息。

5.   技术优点

（1）具有16种标记试剂,单次可同时对2-16个样品进行蛋白差异分析，超过16个样本可以通过设计内参实现多次上机数据之间的比较，不受样本数量的限制。

（2） 不同标记的样本混样后统一处理、上机，具有较好的平行性，减少了样本处理和上机造成的实验误差，提高了定量的准确性和重复性。

（3）是一种体外标记技术，可标记各种动物组织、植物组织、微生物、血浆、体液、细胞培养物、等样本。

（3）该技术不仅可检测胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,还可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

（4）报告离子的相对分子质量较低，低分子量区是质谱定性(质量确定)和定量(丰度比较)较为准确的区域，因此质谱检测更为灵敏可靠。